Película nanoporosa y de nanoespesor.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 8198 (2022) Citar este artículo

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El sangrado incontrolable es una de las causas importantes de mortalidad. Lograr una hemostasia rápida garantiza la supervivencia del sujeto como primeros auxilios durante combates, accidentes de tráfico y cirugías que reducen la mortalidad. El andamio compuesto reforzado con fibras nanoporosas (NFRCS) desarrollado mediante una composición formadora de película hemostática simple (HFFC) (como fase continua) puede desencadenar e intensificar la hemostasia. El NFRCS desarrollado se basó en el diseño estructural de la estructura del ala de libélula. La estructura del ala de libélula consta de venas transversales y venas longitudinales del ala interconectadas con la membrana del ala para mantener la integridad microestructural. El HFFC cubre uniformemente la superficie de las fibras con una película de nanoespesor e interconecta el calibre de algodón (Ct) distribuido aleatoriamente (fase dispersa), lo que da como resultado la formación de una estructura nanoporosa. La integración de fases continuas y dispersas reduce diez veces el coste del producto respecto a los productos comercializados. El NFRCS modificado (tampón o muñequera) se puede utilizar para diversas aplicaciones biomédicas. Los estudios in vivo concluyen que el Cp NFRCS desarrollado desencadena e intensifica el proceso de coagulación en el lugar de aplicación. La NFRCS podría regular el microambiente y actuar a nivel celular debido a su estructura nanoporosa, lo que resultó en una mejor cicatrización de las heridas en el modelo de herida por escisión.

Las hemorragias incontrolables durante los combates, las condiciones intraoperatorias y accidentales pueden causar importantes amenazas a la vida de las víctimas1. Estas condiciones conducen además al aumento total de la resistencia vascular periférica, lo que provoca un shock hemorrágico. Las medidas adecuadas para controlar el sangrado durante y después de la cirugía se consideran una amenaza potencial para la vida2,3. Los grandes vasos sanguíneos lesionados provocan una pérdida de sangre colosal, lo que resulta en ≤ 50% de letalidad en combates y 31% en condiciones intraoperatorias1. La pérdida abundante de sangre provoca una disminución del volumen corporal total, lo que reduce el gasto cardíaco. El aumento de la resistencia vascular periférica total y la alteración progresiva de la microcirculación conducen a la hipoxia de los órganos que sustentan la vida. Si la situación continúa sin una intervención eficaz se puede producir un shock hemorrágico1,4,5. Otras complicaciones incluyen una progresión de la hipotermia y la acidosis metabólica con alteración de la coagulación sanguínea, lo que dificulta el proceso de coagulación sanguínea. El shock hemorrágico severo supone un mayor riesgo de mortalidad6,7,8. Para los shocks de Clase III (etapa progresiva), la transfusión de sangre es necesaria para la supervivencia del paciente durante la morbilidad y mortalidad intraoperatoria, posoperatoria8. Para superar todas las condiciones potencialmente mortales mencionadas anteriormente, desarrollamos un andamio compuesto reforzado con fibras nanoporosas (NFRCS) utilizando una combinación de polímeros astringentes solubles en agua utilizando una concentración mínima de polímero (0,5%).

Utilizando aplicaciones de refuerzo de fibra, se pueden desarrollar productos económicamente viables. Las fibras dispuestas al azar se asemejan a la estructura del ala de la libélula, equilibradas con venas transversales y venas longitudinales del ala. Las venas transversales y las venas longitudinales del ala están interconectadas con la membrana del ala (Fig. 1). NFRCS consiste en un Ct reforzado como sistema esquelético para una mejor resistencia física y mecánica (Fig. 1). Los cirujanos prefieren el medidor de algodón (Ct) durante las cirugías y el vendaje debido a su precio asequible y su competencia. Por lo tanto, considerando sus múltiples beneficios, incluido > 90 % de celulosa cristalina (que contribuye a mejorar la actividad hemostática), se utilizó Ct como sistema esquelético de NFRCS9,10. Se recubrió la superficie del Ct (se observó formación de película de nanoespesor) y se interconectó con la composición formadora de película hemostática (HFFC). El HFFC actúa como un pegamento de matriz que mantiene unido el Ct dispuesto aleatoriamente. El diseño desarrollado transfiere tensiones dentro de fases dispersas (fibras reforzadas). Al utilizar concentraciones mínimas de polímero, es un desafío lograr una estructura nanoporosa con buena resistencia mecánica. Además, no es fácil personalizarlo en varias formas para diferentes aplicaciones biomédicas.

La imagen representa la representación esquemática del diseño estructural de NFRCS basado en la estructura del ala de libélula (A). La imagen muestra la analogía comparativa de la estructura del ala de la libélula (interconexión de las venas transversales y las venas longitudinales del ala) y una micrografía de una sección transversal de Cp NFRCS, (B). Representación esquemática de NFRCS.

NFRCS se desarrolló utilizando HFFC como fase continua para resolver las limitaciones anteriores. El HFFC está compuesto por diferentes polímeros astringentes formadores de película, que incluyen quitosano (como polímero astringente base) en combinación con metilcelulosa (MC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC 50 cp) y alcohol polivinílico (PVA) (125 kDa), respectivamente. como polímeros de soporte que facilitan la intensificación de la formación del coágulo. La adición de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) mejora la capacidad de absorción de humedad del NFRCS. Se añadió polietilenglicol 400 (PEG 400) para mejorar la reticulación del polímero dentro de la mezcla polimérica híbrida. Se recubrieron la superficie del Ct con tres composiciones hemostáticas de HFFC diferentes (Cm HFFC, Ch HFFC y Cp HFFC), es decir, quitosano con MC (Cm), quitosano con HPMC (Ch) y quitosano con PVA (Cp). Las actividades hemostáticas y de cicatrización de heridas de NFRCS fueron confirmadas por varios estudios de caracterización in vitro e in vivo. El compuesto sugerido por la NFRCS se puede utilizar para personalizar varias formas de andamios para satisfacer necesidades específicas.

Además, la NFRCS se puede modificar en forma de vendaje o rollo para cubrir toda el área de lesiones de las extremidades inferiores y otras partes del cuerpo. Especialmente para lesiones de extremidades en combate, el diseño NFRCS desarrollado se puede modificar en medio brazo o pierna (Figura complementaria S11). NFRCS se puede convertir en una muñequera con la ayuda de pegamento adhesivo para tejidos que se puede emplear para controlar el sangrado durante lesiones graves y suicidas en la muñeca. Nuestra principal preocupación era desarrollar un NFRCS con una utilización mínima de polímeros que pudiera estar disponible para una gran población (por debajo del umbral de pobreza) y que pudiera incluirse en el botiquín de primeros auxilios. El diseño de la NFRCS fue simple, eficiente y económico, lo que resulta útil para los nativos y podría tener un impacto a nivel mundial.

El quitosano (peso molecular 80 kDa) y el amaranto se adquirieron de Merck Chemicals, India. La hidroxipropilmetilcelulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 y la metilcelulosa se adquirieron de Loba Chemie Pvt. Ltd. Ltd., Bombay. El alcohol polivinílico (peso molecular 125 kDa) (87–90 % hidrolizado) se adquirió de National Chemicals, Gujarat. La polivinilpirrolidina K30 se adquirió de Molychem, Mumbai; el medidor de algodón esterilizado se adquirió de Ramaraju quirúrgico cotton mills Ltd., Tamil Nadu, y agua Milli Q (Sistema de purificación de agua Direct-Q3, Merck, India) como vehículo.

Se adoptó el método de criodesecación para el desarrollo de NFRCS11,12. Todas las composiciones de HFFC se prepararon (Tabla 1) usando un agitador mecánico. En un agitador mecánico, se preparó una solución de quitosano al 0,5% usando ácido acético al 1% en agua mediante agitación continua a 800 rpm. Se añadió una cantidad exactamente pesada del polímero de soporte mencionado en la Tabla 1 a la solución de quitosano y se sometió a agitación hasta que se logró una solución polimérica transparente. Se añadieron PVP K30 y PEG 400 a la mezcla obtenida según las cantidades mencionadas en la Tabla 1 y se mantuvieron en agitación hasta que se obtuvo una solución polimérica viscosa y transparente. La solución polimérica obtenida se sonicó en un baño durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la mezcla polimérica. Como se muestra en la Figura complementaria S1 (b), Ct se distribuyó uniformemente en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (molde de fundición) y se agregaron 5 ml de HFFC.

La placa de seis pocillos se sonicó en un baño durante 60 minutos para lograr una humectación y distribución uniformes de HFFC en la red de Ct. Posteriormente, la placa de seis pocillos se congeló a -20 °C durante 8 a 12 h. La placa congelada se criosecó durante 48 h para lograr NFRCS de diferentes composiciones. Se utilizó el mismo procedimiento para producir diferentes formas y estructuras como tampones o tampones de forma cilíndrica, o cualquier otra forma para diferentes aplicaciones.

Se disolvió quitosano (80 kDa) (3%) pesado con precisión en ácido acético al 1% usando un agitador magnético. A la solución de quitosano obtenida, se le añadió PEG 400 al 1% y se dejó en agitación durante 30 min. La solución obtenida se transfirió a un recipiente de forma cuadrada o rectangular y se congeló a -80 °C durante 12 h. La muestra congelada se criosecó durante 48 h para obtener Cs13 poroso.

Los NFRCS desarrollados se experimentaron con espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japón) para confirmar la compatibilidad química del quitosano con otros polímeros14,15. El espectro FTIR de todas las muestras de prueba se obtuvo ejecutando 32 escaneos (ancho de rango espectral de 400 a 4000 cm-1).

La tasa de absorción en sangre (BAR) para todas las formulaciones se estimó utilizando el método informado por Chen et al.16 con ligeras modificaciones. El NFRCS desarrollado de todas las composiciones se secó en una estufa de vacío a 105 °C durante la noche para eliminar el disolvente residual. Se colocaron 30 mg de NFRCS (peso inicial de la muestra - W0) y 30 mg de Ct (control positivo) en diferentes placas de Petri que contenían sangre premezclada con citrato de sodio al 3,8%. A intervalos de tiempo predeterminados, es decir, 5, 10, 20, 30, 40 y 60 s, se retiraron los NFRCS y se limpió su superficie para eliminar la sangre no absorbida colocando las muestras en Ct durante 30 s. Se consideró el peso final del NFRCS con sangre absorbida (W1) en cada momento16. El porcentaje de BAR se calculó utilizando la siguiente fórmula:

El tiempo de coagulación sanguínea (BCT) se determinó siguiendo el método informado por Wang et al.17. El tiempo que tardó la sangre completa (sangre de rata premezclada con citrato de sodio al 3,8%) para formar un coágulo en presencia de NFRCS se consideró BCT de la muestra de prueba. Se colocó NFRCS (30 mg) de diferentes composiciones en 10 ml de viales con tapa de rosca y se incubó a 37 °C. Se añadió sangre (0,5 ml) a los viales y se añadieron 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M para activar la coagulación sanguínea. Finalmente, los viales se voltearon (hasta 180°) cada 15 s hasta que se formó un coágulo denso. El BCT de la muestra se estimó con base en el número de vuelcos de los velos17,18. Con base en el BCT, se seleccionaron las dos mejores formulaciones de NFRCS de Cm, Ch y Cp para estudios de caracterización adicionales.

El BCT de las composiciones Ch NFRCS y Cp NFRCS se determinó implementando el método informado por Li et al.19. Los Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (control positivo) de 15 × 15 mm2 se colocaron en una placa petri individual (37 °C). La sangre con citrato de sodio al 3,8% se mezcló con CaCl2 0,2 ​​M en una proporción de volumen de 10:1 para desencadenar la coagulación. Se agregaron 20 µl de sangre de rata mezclada con CaCl2 0,2 ​​M a la superficie de las muestras y se colocaron en una placa de Petri vacía. La sangre dispensada en la placa de Petri vacía sin Ct se consideró como control. A intervalos de tiempo regulares de 0, 3 y 5 minutos, se terminó la coagulación agregando 10 ml de agua desionizada (DI) a una muestra que contenía placas de Petri sin alterar el coágulo de sangre. Los glóbulos rojos (RBC) no coagulados sufren hemólisis en presencia de agua DI y liberan hemoglobina. La hemoglobina se midió en diferentes puntos de tiempo (HA (t)) utilizando un espectrofotómetro UV-Visible a 540 nm (λ máx de hemoglobina). La absorbancia absoluta de hemoglobina (AH (0)) de 20 µL de sangre en 10 ml de agua desionizada a 0 min se consideró un estándar de referencia. La absorbancia relativa de la hemoglobina (RHA) de la sangre coagulada se calculó mediante HA (t)/HA (0), utilizando el mismo lote de sangre.

Utilizando el analizador de textura (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EE. UU.), se determinó la propiedad de adhesión de NFRCS hacia el tejido dañado. Se presionó un molde de forma cilíndrica con fondo abierto contra el lado interior de la piel porcina (sin ninguna capa de grasa). Las muestras (Ch NFRCS y Cp NFRCS) se aplicaron mediante una cánula en el molde de forma cilíndrica a la piel porcina para formar adhesión. Después de 3 minutos de incubación a temperatura ambiente (RT) (25 °C), se registró la fuerza de adhesión de NFRCS a una velocidad constante de 0,5 mm/s20.

La característica clave del sellador quirúrgico es intensificar la coagulación sanguínea con una pérdida mínima de sangre. La coagulación sin pérdida de sangre de la NFRCS se estimó utilizando el método informado anteriormente con pocas modificaciones19. Se hizo un tubo de microcentrífuga (2 ml) (diámetro interior de 10 mm) con orificios de 8 x 5 mm2 de área en un lado del tubo de centrífuga (que representa una herida abierta). Se utilizó NFRCS para cerrar el orificio y cinta transparente para sellar los márgenes exteriores. Se añadieron 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tubo de microcentrífuga lleno con sangre premezclada con citrato de sodio al 3,8%. Después de 10 minutos, se retiraron los tubos de microcentrífuga de la placa de Petri y se determinó el aumento de peso de la placa de Petri debido a la fuga de sangre del NFRCS (n = 3). La pérdida de sangre de Ch NFRCS y Cp NFRCS se comparó con la de Cs.

Según el método informado por Mishra y Chaudhary21 con ligeras modificaciones, se determinó la integridad húmeda de NFRCS. El NFRCS se colocó en un matraz cónico de 100 ml que contenía 50 ml de agua y se agitó durante 60 s sin formar un vértice. La integridad física de la muestra fue inspeccionada visualmente y priorizada según la adquisición21.

La fuerza de unión del HFFC con Ct se examinó utilizando un método previamente informado con pocas modificaciones22. La integridad de la capa superficial se estimó exponiendo NFRCS a ondas sónicas (estímulos externos) en presencia de agua mili Q (Ct). Los NFRCS desarrollados de Ch NFRCS y Cp NFRCS se colocaron en un vaso de precipitados que contenía agua y se sonicaron en un baño durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 30 minutos, respectivamente. Después del secado, la diferencia porcentual en el peso inicial y final del NFRCS se utilizó para calcular el porcentaje de pérdida de material (HFFC). La fuerza de unión o la pérdida de material de la superficie fue respaldada aún más por BCT in vitro. La eficacia de unión del HFFC hacia Ct asegura la coagulación de la sangre y una capa flexible en la superficie de Ct22.

La uniformidad de la NFRCS desarrollada se determinó basándose en el BCT de muestras (30 mg) recortadas de posiciones seleccionadas al azar de la NFRCS total. Se siguió el procedimiento BCT mencionado anteriormente para determinar la uniformidad de la NFRCS. El grado de cercanía entre las cinco muestras asegura la uniformidad de la capa superficial y la deposición de HFFC en la red Ct.

El área nominal de contacto con la sangre (NBCA) se determinó siguiendo el método informado anteriormente con algunas modificaciones19. Se intercalaron 20 µl de sangre entre dos superficies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs y se permitió que la sangre se coagulara. Después de 1 h, se separaron ambas piezas del andamio y se midió manualmente el área del coágulo. El promedio de tres réplicas se consideró como el NBCA de NFRCS19.

Se utilizó el análisis de sorción dinámica de vapor (DVS) para estimar la eficiencia de NFRCS para absorber la humedad del ambiente externo o en el sitio de la lesión responsable del inicio de la coagulación. El sistema DVS estima o registra la absorción y pérdida de vapor de la muestra gravimétricamente utilizando una balanza ultrasensible con una resolución de masa de ± 0,1 µg. La presión de vapor parcial (humedad relativa) se generó utilizando un controlador electrónico de flujo másico alrededor de la muestra mezclando gases portadores saturados y secos. Según las directrices de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de absorción de humedad por las muestras, las muestras se clasificaron en 4 categorías (0–0,012 % p/p − no higroscópicas, 0,2 %–2 % p/p ligeramente higroscópicas, 2–15 % moderadamente higroscópico y > 15% muy higroscópico)23. La eficiencia de absorción de humedad de NFRCS de Ch NFRCS y Cp NFRCS se determinó mediante el analizador TA TGA Q5000 SA DVS. Durante el proceso se obtuvieron el tiempo de ejecución, la humedad relativa (HR) y la masa en tiempo real de la muestra a 25 °C24. El contenido de humedad se calculó mediante un análisis de masa preciso del NFRCS mediante la siguiente ecuación:

mientras que MC es el contenido de humedad del NFRCS.m1 es la masa seca del NFRCS.m2 es la masa en tiempo real del NFRCS a la humedad relativa establecida.

El área de superficie total se estimó mediante un experimento de adsorción de nitrógeno con nitrógeno líquido después de vaciar las muestras a 25 °C durante 10 h (< 7 × 10–3 Torr). El área de superficie total, el volumen de poros y el tamaño de los poros de NFRCS se determinaron mediante Quantachrome, NOVA 1000e, Austria, con el software RS 23225.

Los eritrocitos al 5% (solución salina como diluyente) se prepararon a partir de sangre completa. Posteriormente, las alícuotas de HFFC (0,25 ml) se transfirieron a una placa de 96 pocillos y una masa de eritrocitos al 5 % (0,1 ml). La mezcla se incubó a 37 °C durante 40 min. Se consideró como control positivo la mezcla de masa eritrocitaria con suero y como control negativo el suero fisiológico con masa eritrocitaria. La hemoaglutinación se determinó con base en la escala de Stayitsky. La escala propuesta fue la siguiente: + + + + Aglutinado granular compacto; + + + Tapete liso en el fondo del pozo con bordes doblados; + + Alfombra lisa en el fondo del pozo, bordes irregulares; + anillo rojo estrecho alrededor del borde de la alfombra lisa; - (negativo) el discreto botón rojo en el centro del pozo inferior12.

La hemocompatibilidad de NFRCS se estudió siguiendo el método de la Organización Internacional de Normalización (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. El método gravimétrico informado por Singh et al. se implementó con pocas modificaciones para evaluar la formación de trombos en presencia o en la superficie de NFRCS. Los 500 mg de Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS se incubaron en solución salina tampón fosfato (PBS) a 37 °C durante 24 h. Después de 24 h, se descartó el PBS y la NFRCS se trató con 2 ml de sangre con citrato de sodio al 3,8%. A la superficie NFRCS, se agregaron 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a la muestra incubada. Después de 45 minutos, se detuvo la coagulación de la sangre agregando 5 ml de agua destilada. La sangre coagulada en la superficie de NFRCS se trató con una solución de formaldehído al 36-38%. Los coágulos de sangre fijados con formaldehído se secaron y pesaron. El porcentaje de trombogenicidad se estimó calculando el peso del vaso en ausencia de sangre y muestra (control negativo) y el peso del vaso con sangre (control positivo)26.

Como confirmación preliminar, las muestras se visualizaron bajo microscopía óptica para comprender la capacidad del HFFC para recubrir la superficie, interconectar el Ct y formar poros en la red de Ct. La sección delgada de NFRCS de Ch y Cp se recortó con un bisturí quirúrgico. La sección obtenida se colocó sobre un portaobjetos de vidrio, se cubrió con un cubreobjetos y se fijaron los bordes con pegamento. Los portaobjetos preparados se observaron bajo un microscopio óptico y las imágenes se capturaron con diferentes aumentos28.

Se adoptó la técnica de microscopía fluorescente para visualizar la deposición del polímero en la red de Ct, que se basa en el método informado por Rice et al.29. La composición de HFFC utilizada para la formulación se mezcló con un tinte fluorescente (amaranto) y se prepararon NFRCS (Ch & Cp) según el método mencionado anteriormente. De la muestra obtenida se recortó una sección delgada de NFRCS y se colocó en el portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos. El portaobjetos preparado se visualizó bajo un microscopio fluorescente utilizando un filtro verde (310–380 nm). Las imágenes se capturaron con un aumento de 4 × para comprender la interconexión de Ct y la deposición excesiva de polímero en la red de Ct.

La topografía de la superficie de NFRCS de Ch y Cp se determinó en modo de golpeteo usando un microscopio de fuerza atómica (AFM) con un voladizo TESP súper afilado: 42 N / m, 320 kHz, 2–5 nm ROC, Bruker, Taiwán. La rugosidad de la superficie se determinó mediante la raíz cuadrática media (RMS) utilizando un software (procesador de imágenes de sonda de escaneo). Las distintas ubicaciones de NFRCS se visualizaron en imágenes 3D para comprobar la uniformidad de la superficie30. La desviación estándar de la evaluación en el área dada se definió como rugosidad de la superficie. Se empleó la ecuación RMS para cuantificar la rugosidad de la superficie del NFRCS31.

El estudio basado en FESEM se realizó para comprender la morfología de la superficie de Ch NFRCS y Cp NFRCS (que mostraron mejores BCT que Cm NFRCS) utilizando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio. Los estudios FESEM se realizaron según el método informado por Zhao et al.32 con ligeras modificaciones. Se trataron NFRCS de 20 a 30 mg de Ch NFRCS y Cp NFRCS con 20 µl de sangre de rata premezclada con citrato de sodio al 3,8 %. Se agregaron 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M a las muestras tratadas con sangre para iniciar la coagulación y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Además, se eliminó una cantidad excesiva de glóbulos rojos de la superficie del NFRCS mediante lavado con solución salina.

Posteriormente, las muestras se trataron con glutaraldehído al 0,1% y posteriormente se secaron a 37 °C en un horno de aire caliente para eliminar la humedad. Las muestras secas fueron recubiertas por pulverización catódica y sometidas a análisis32. Las otras imágenes capturadas durante el análisis fueron la formación de coágulos en la superficie de una sola fibra de algodón, la deposición de polímero entre el Ct, la morfología de los glóbulos rojos (forma), la integridad del coágulo y la morfología de los glóbulos rojos en presencia de NFRCS. El área de NFRCS no tratada y NFRCS tratada de Ch y Cp incubadas con sangre se escaneó en busca de iones elementales respectivos (sodio, potasio, nitrógeno, calcio, magnesio, zinc, cobre y selenio)33. Se comparó el porcentaje de iones elementales entre muestras tratadas y no tratadas para comprender la acumulación de iones elementales en la formación del coágulo y la uniformidad del coágulo sanguíneo.

El espesor de la capa superficial de Cp HFFC sobre la superficie de Ct se determinó utilizando FESEM. La sección transversal de Cp NFRCS se recortó del andamio y se recubrió mediante pulverización catódica. La muestra recubierta por pulverización catódica obtenida se observó bajo FESEM y se midió el espesor de la capa superficial34,35,36.

La micro-CT de rayos X proporciona visualización no destructiva en 3D de alta resolución y permite investigar la disposición estructural interna de NFRCS. La micro-CT utiliza un haz de rayos X que pasa a través de la muestra para registrar el coeficiente de atenuación lineal local de los rayos X en la muestra, lo que ayuda a generar información morfológica37. La disposición interna del Ct en Cp NFRCS y la Cp NFRCS tratada con sangre se estudió mediante micro-CT para comprender la eficiencia de imbibición y la coagulación sanguínea en presencia de NFRCS37,38,39. La estructura 3D de la sangre tratada y de una muestra de Cp NFRCS no tratada se reconstruyó mediante micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Alemania). Se generaron múltiples radiografías desde diferentes ángulos (idealmente cubriendo 360°) para desarrollar una imagen 3D de NFRCS mediante el software VG STUDIO-MAX versión 2.2. Los datos de proyecciones recopilados se reconstruyeron en imágenes de volumen 3D utilizando el software ScanIP Academic 3D simple adecuado37.

Además, para comprender la distribución de los coágulos sanguíneos, se agregaron 20 µl de sangre con citrato premezclado al NFRCS y 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M para iniciar la coagulación sanguínea. La muestra preparada se dejó para coagulación. La superficie de NFRCS se trató con glutaraldehído al 0,5% y se secó en un horno de aire caliente a 30-40 °C durante 30 min. Se escaneó el coágulo de sangre formado en el NFRCS y se reconstruyó y visualizó una imagen en 3D del coágulo de sangre.

El ensayo antimicrobiano se realizó para Cp NFRCS (que se compara mejor con Ch NFRCS) utilizando un método previamente informado con pocas modificaciones40. La actividad antimicrobiana de Cp NFRCS y Cp HFFC se estudió utilizando tres microorganismos de prueba diferentes [Staphylococcus aureus (S. aureus) (bacterias grampositivas), Escherichia coli (E. coli) (bacterias gramnegativas) y Candida albicans (C. albicans)] que se cultivaron en agar en placas de Petri en una incubadora. Se inocularon uniformemente 50 ml de cultivo bacteriano de levitación diluido con una concentración de 105–106 ufc ml-1 en el medio de cultivo de agar. Los medios de cultivo se vertieron en placas de Petri y se dejaron solidificar. En la superficie de las placas esparcidas con agar, se hicieron pocillos para llenar el HFFC (3 pocillos para HFFC y 1 para un control negativo). Se llenaron 200 µl de HFFC en 3 pocillos y se añadieron 200 µl de PBS de pH 7,4 al 4º pocillo. En el otro lado de la placa de Petri, se colocaron discos de 12 mm de Cp NFRCS sobre agar solidificado y se humedecieron con PBS (pH 7,4). Los discos de fármacos ciprofloxacina, ampicilina y fluconazol se consideraron estándares de referencia para S. aureus, E. coli y C. albicans. La zona de inhibición se midió manualmente y se capturaron imágenes digitales de la zona de inhibición.

Después de obtener la aprobación ética de la institución, el estudio se llevó a cabo en el Kasturba Medical College, un hospital del sur de la India, con sede en educación e investigación, en Manipal, Karnataka, India. El protocolo experimental de TEG in vitro fue examinado y aprobado por el Comité de Ética Institucional, Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Se reclutaron los sujetos procedentes de los donantes voluntarios de sangre (de edades comprendidas entre 18 y 55 años) del banco de sangre del hospital. Además, se tomó un formulario de consentimiento informado de los voluntarios para la recolección de muestras de sangre. Se utilizó TEG nativo (N-TEG) ​​para estudiar el efecto de la composición de Cp HFFC en sangre entera premezclada con citrato de sodio. N-TEG estaba bien establecido por su papel en la reanimación en el lugar de atención, lo que plantea desafíos para los médicos debido al retraso en el tiempo de los resultados (ensayo de coagulación convencional) que puede tener implicaciones clínicas41. El análisis N-TEG se realizó utilizando sangre completa. Se tomó el consentimiento informado y la historia detallada de todos los participantes. Los participantes con complicaciones hemostáticas o trombóticas como embarazo/posparto o enfermedad hepática no participaron en el estudio. También se excluyeron del estudio los sujetos que tomaban medicación que influye en la cascada de la coagulación. Se realizaron pruebas de laboratorio básicas (hemoglobina, tiempo de protrombina, tromboplastina activada y recuento de plaquetas a todos los participantes según el procedimiento estándar42. N-TEG determina las propiedades viscoelásticas de un coágulo sanguíneo, la construcción inicial del coágulo, la interacción del pellet, el fortalecimiento del coágulo y lisis del coágulo. El análisis N-TEG proporciona la salida gráfica y numérica del efecto colectivo de varios elementos celulares y plasma 42. El análisis N-TEG se realizó para dos volúmenes diferentes de Cp HFFC (10 µL y 50 µL). Se realizó agregando 10 µL de Cp HFFC con 1 ml de sangre entera citratada. A 1 ml de (Cp HFFC + sangre citratada), se agregaron 340 µL de sangre de la mezcla a 20 µL de CaCl2 0,2 ​​M que contenía una copa de TEG. Posteriormente, la copa de TEG se cargó en un TEG® 5000, US para medir R, K, ángulo α, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % de la muestra de sangre en presencia de Cp HFFC41.

El protocolo de estudios in vivo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Kasturba Medical College, Manipal Academy of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales se realizaron según las directrices del Comité para el control y supervisión de experimentos con animales (CPCSEA). Todos los estudios in vivo de NFRCS (con un tamaño de 2 × 2 cm2) se realizaron en ratas wistar hembra (de 200 a 250 g). Todos los animales se aclimataron a 24-26 °C y los animales tuvieron libre acceso a una dieta estándar y agua ad libitum. Todos los animales se separaron aleatoriamente en diferentes grupos, y cada grupo estaba formado por tres animales. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con Animal Research: Reporting of in vivo Experiments43. Antes del estudio, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal (IP) de 20 a 50 mg de ketamina (por 1 kg de peso corporal) y 2 a 10 mg de cóctel de xilazina (por 1 kg de peso corporal). Luego del estudio, se calculó el volumen hemorrágico estimando la diferencia en el peso inicial y final de la muestra; se consideró como volumen hemorrágico de la muestra el valor promedio obtenido de tres ensayos44.

El modelo de amputación de cola de rata se implementó para comprender el potencial de NFRCS en la regulación del sangrado en lesiones externas, combates o accidentes de tráfico (modelo de lesiones externas). Se amputó el 50% de la cola con el bisturí quirúrgico y se dejó durante 15 s en el aire para asegurar un sangrado normal. Además, se colocó una muestra de prueba en la cola de la rata aplicando presión (Ct, Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS). Se registraron el volumen hemorrágico y el BCT de las muestras de prueba (n = 3)17,45.

La eficacia del NFRCS en el control de la presión en combate se estudió utilizando un modelo de arteria femoral superficial. La arteria femoral se expuso y se punzó con una aguja de cánula 24G y se dejó sangrar durante 15 s. Después de observar un sangrado incontrolable, la muestra de prueba se colocó en el sitio de punción aplicando presión. Después de la aplicación inmediata de la muestra de prueba, se registró el tiempo de coagulación y se observó la eficiencia hemostática durante los siguientes 5 minutos. Se repitió el mismo procedimiento con Cs y Ct46.

Dowling et al. 47 propusieron un modelo de lesión hepática para estimar el potencial hemostático del material hemostático en condiciones de sangrado intraoperatorio. Se registró el BCT de las muestras de Ct (control negativo), Cs (control positivo), Ch NFRCS y Cp NFRCS. Al realizar una laparotomía de la línea media, se expuso la vena cava superhepática de la rata. Posteriormente, se extirpó la porción del lóbulo distal izquierdo con tijeras. Se hizo una incisión en el hígado con un bisturí y se dejó sangrar durante unos segundos. Se colocaron muestras de prueba pesadas con precisión de Ch NFRCS y Cp NFRCS sobre la superficie de la lesión sin ninguna presión positiva y se registró el BCT. Posteriormente se estudió al grupo control (Ct) aplicando presión, seguido de Cs sin alterar la lesión durante 30 s47.

Se realizó un ensayo de curación de heridas in vivo para estimar la propiedad de curación de heridas del NFRCS basado en polímero desarrollado utilizando el modelo de herida por escisión. Se optó por el modelo de herida de escisión y se realizó según el método descrito anteriormente con pocas modificaciones19,32,48. Todos los animales fueron anestesiados, como se indicó anteriormente. Se realizó una lesión circular profunda en la piel del flanco dorsal utilizando un punzón de biopsia (12 mm). El área de la herida preparada se cubrió con Cs (control positivo), Ct (para comprender que la adhesión del algodón interfiere con la curación), Ch NFRCS y Cp NFRCS (grupos de prueba) y un control negativo sin ningún tratamiento. Cada día alternativo del estudio, se midió el área de la herida de todas las ratas. El área de la herida se capturó con una cámara digital y se cubrió con un apósito nuevo. El porcentaje de cierre de la herida se midió utilizando la siguiente fórmula:

Según el porcentaje de cierre de la herida en el día 12 del estudio, se extirpó la piel de rata del mejor grupo ((Cp NFRCS) y el grupo de control) y se estudió mediante tinción con H&E y tinción con tricrómico de Masson. Los procedimientos de tinción implementados se siguieron según los métodos informados anteriormente49,50. En resumen, después de la fijación con formalina al 10%, las muestras se deshidrataron utilizando series graduadas de alcohol. Se obtuvo una sección delgada (de 5 μm de espesor) de tejido extirpado utilizando un micrótomo. La sección delgada en serie de control y Cp NFRCS se trató con hematoxilina y eosina para estudiar los cambios histopatológicos. Se empleó la tinción tricrómica de Masson para identificar la formación de fibras de colágeno49. Los resultados obtenidos fueron investigados de forma ciega por un patólogo.

La estabilidad de la muestra Cp NFRCS se estudió a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C/ 60% HR ± 5%) durante 12 meses51. Cp NFRCS se inspeccionó visualmente (cambio de color y crecimiento microbiano en la superficie) y se probó la resistencia al pliegue y el BCT según el método anterior explicado en los materiales y métodos.

La escalabilidad y reproducibilidad de Cp NFRCS se estudió preparando Cp NFRCS de tamaño 15 × 15 cm2. Además, de varias partes del Cp NFRCS, se recortaron 30 mg de muestras (n = 5) y se estimó el BCT de las muestras de prueba, como se indicó anteriormente en la metodología.

Intentamos desarrollar varias formas y estructuras utilizando la composición de Cp NFRCS para diversas aplicaciones biomédicas. La forma o estructura incluye tampones con forma de cono para controlar el sangrado nasal, cirugías dentales y tampones con forma cilíndrica para controlar el sangrado vaginal.

Todos los conjuntos de datos se expresaron como media ± DE y se analizaron mediante ANOVA seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni (∗ p <0,05) utilizando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.).

Todos los procedimientos realizados en investigaciones con participantes humanos se realizaron siguiendo los estándares del instituto y el comité nacional de investigación y con la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. Todos los participantes fueron informados sobre las características del estudio y su carácter voluntario. Los datos de los participantes se mantuvieron confidenciales después de su recopilación. El protocolo experimental de TEG in vitro fue examinado y aprobado por el Comité de Ética Institucional, Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020). Para la recolección de muestras de sangre, el voluntario ha firmado un formulario de consentimiento informado.

Todos los procedimientos realizados en investigaciones con animales se realizaron siguiendo la Facultad de Medicina de Kasturba, Academia de Educación Superior de Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Todos los experimentos con animales diseñados se ajustaron a las directrices del Comité para el control y supervisión de experimentos con animales (CPCSEA). Todos los autores cumplieron con las pautas ARRIVE.

Se analizó el espectro FTIR de todos los NFRCS y se comparó con el espectro de quitosano que se muestra en la Fig. 2A. Los picos espectrales característicos del quitosano (reportados) se encontraron en 3437 cm-1 (estiramiento O-H y estiramiento N-H, superpuestos), 2945 y 2897 cm-1 (estiramiento CH), 1660 cm-1 (deformación NH2). , 1589 cm-1 (curvatura N-H), 1157 cm-1 (estiramiento puente -O-), 1067 cm-1 (estiramiento C-O, grupo hidroxilo secundario), 993 cm-1 (estiramiento CO, primario -OH )52,53,54. La Tabla complementaria S1 representa los valores espectrales de absorción FTIR de quitosano (informados), quitosano puro, NFRCS de Cm, Ch y Cp. El espectro FTIR de todos los NFRCS (Cm, Ch y Cp) ha mostrado bandas de absorción características como las del quitosano puro sin cambios significativos (Fig. 2A). Los resultados de FTIR confirman que no hay interacción química o física entre los polímeros utilizados para desarrollar NFRCS, lo que representa la naturaleza inerte de los polímeros utilizados.

Características de caracterización in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. (A) Representa el espectro FTIR combinado de quitosano y formulaciones Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS en compresión. (B) a) La tasa de absorción en sangre total de NFRCS de Cm, Ch, Cp y Cg, (n = 3); La muestra de Ct mostró una BAR alta ya que el medidor de algodón tiene una alta eficiencia de absorción; b) Representación pictórica de muestras absorbidas en sangre después de la absorción de sangre. C La representación gráfica de BCT de las muestras de prueba (Cp NFRCS tiene el mejor BCT (15 s, n = 3)). Los datos en C, D, E y G se mostraron como media ± DE y las barras de error representan DE, ***p < 0,0001.

La NFRCS, con un excelente apoyo a la tasa de absorción de sangre, controla el sangrado masivo e inmanejable de la lesión. La Figura 2B muestra la tasa de absorción en sangre de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Ct (control positivo), y 2B (b) representa las imágenes capturadas durante el estudio. Todos los NFRCS y Ct se hincharon hasta 60 s; sin embargo, la BAR de Ch NFRCS (539,38 ± 14,14 mg) fue más significativa que Cm NFRCS (444,42 ± 91,58 mg) y Cp NFRCS (493,92 ± 83,69). Los resultados obtenidos de Ct (1731,93 ± 10,20 mg) mostraron más BAR que otras muestras de prueba. Se observó una diferencia significativa entre Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS con ***p < 0,0001%.

La hidrofilicidad del material o polímero hemostático es un factor esencial en el diseño de selladores quirúrgicos o armazones hemostáticos16. El BCT in vitro ayuda a comprender el efecto de las HFFC para promover la coagulación en el lugar de aplicación. El BCT del andamio Cs, Cm NFRCS, Ch NFRCS y Cp NFRCS fue de 65 ± 8,66, 65 ± 8,66, 30 ± 0,00 y 15 ± 0,00 s, respectivamente. Entre todas las muestras, Cp NFRCS mostró menos BCT. Los resultados comparativos se representaron gráficamente en la Fig. 2C. La Figura complementaria S3 representa BCT y las imágenes capturadas durante el estudio. Además, la hemólisis y el BCT también se determinaron según el método de hemólisis19. Se encontró una diferencia significativa en el tiempo de coagulación sanguínea con p <0,0001% entre Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS, mientras que no se observó ninguna diferencia significativa entre Cm y Cs; Cp NFRCS y Ch NFRCS.

Se determinó el BCT de la NFRCS y se comparó con el Cs. Según las directrices ISO 10993-4, según el porcentaje de hemólisis, los biomateriales se pueden clasificar en tres categorías diferentes: hemolíticos (> 5%), ligeramente hemolíticos (2 a 5%) y no hemolíticos (< 2%). 55. Ch NFRCS y Cp NFRCS no fueron hemolíticos (porcentaje de hemólisis <2%) y Cs fue hemolítico (porcentaje de hemólisis es>5%). La RHA (t) a los 3 min y 5 min fue 1,41 ± 0,352%, 0,99 ± 0,246%, 1,81 ± 0,017% y 1,70 ± 0,007%, 17,33 ± 0,779% y 8,29 ± 0,177% de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs, respectivamente (Fig. 3Aa). La Figura 3A (b) representa la lisis de glóbulos rojos en presencia de muestras en blanco y de prueba. La Figura 3A (c) representa las observaciones capturadas por la FESEM, que muestra la estructura intacta de RBC. Cuanto menor es la RHA (t), más rápida es la formación del coágulo en presencia de biomaterial y menor es la hemólisis de los glóbulos rojos. Los resultados obtenidos de las muestras de prueba (Cs y Cp NFRCS; Ch NFRCS y Cp NFRCS) para hemólisis mostraron una diferencia significativa con ***p < 0,0001%.

La imagen de arriba representa la evaluación in vitro de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs. (A) a) Representación gráfica del porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos en presencia de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (n = 3); b). Imágenes capturadas durante el ensayo de hemólisis; C). Representa las imágenes FESEM capturadas desde la superficie de Cp NFRCS y Ch NFRCS tratados con sangre. (B) a) Cantidad de sangre perdida antes de la coagulación sanguínea en presencia de muestras de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs (n = 3), no se observó pérdida de sangre para Ch NFRCS y Cp NFRCS; b) Las imágenes digitales capturadas durante el estudio de muestras de Ch NFRCS y Cp NFRCS de coagulación sanguínea in vitro antes de la pérdida de sangre. (C) Las imágenes digitales anteriores representan la integridad húmeda de Ch NFRCS y Cp NFRCS a 0 s y 60 s (n = 3). (D) Representación gráfica de la integridad de la capa superficial cuando se expone a estímulos externos (ondas sónicas) (n = 3). (E) Representación gráfica de NBCA de muestras de prueba (n = 3). (F) La imagen de arriba representa la isoterma DVS de muestras Ch NFRC y Cp NFRCS (higroscópicas). (G) La imagen representa la aglomeración de eritrocitos en presencia de muestras de Cs, Ct, Ch HFFC y Cp HFFC (Cp HFFC mostró el mejor EAgT en comparación con otras muestras). Los datos de las imágenes A, B, D y E se representan como media ± DE, n = 3, con ***p < 0,0001.

La pérdida de sangre y la fuerte adhesión de los coágulos son problemas graves asociados con los materiales o andamios hemostáticos hidrófilos19. Se determinó la propiedad de adhesión del NFRCS. Tanto Ch NFRCS como Cp NFRCS mostraron una adhesión mínima con una carga máxima de 43 gy 75 g. Por lo general, el algodón se adhiere a la superficie húmeda o al tejido dañado después de la coagulación de la sangre o del secado lento de la superficie de la herida, interfiere con el proceso de curación de la herida a medida que la herida se distribuye al cambiar el apósito. La mínima adhesión tisular de NFRCS garantiza una capa superficial uniforme del Ct. En el segundo, cuarto o sexto día del ensayo de cicatrización de heridas, NFRCS no mostró ninguna adhesión al tejido, lo que confirmó aún más la propiedad de adhesión al tejido de NFRCS. La Figura complementaria S2 representaba los gráficos generados por el sistema de adhesión de tejidos.

Se determinó la coagulación sin pérdida de sangre de Ch NFRCS y Cp NFRCS. La pérdida de sangre de Ch NFRCS y Cp NFRCS se comparó con Ct (control negativo) y Cs (control positivo). Los resultados mostraron que la coagulación sanguínea fue instantánea sin pérdida de sangre en el caso de Ch NFRCS y Cp NFRCS. Ct y Cs mostraron 0,64 gy 0,06 g de pérdida sanguínea (Fig. 3Ba). La estructura nanoporosa (<5 nm) y FRC de Ch NFRCS y Cp NFRCS no permitió que la sangre fluyera a través del orificio del tubo de microcentrífuga. La Figura 3B (b) representa las imágenes digitales capturadas durante el estudio de Ch NFRSC y Cp NFRCS.

Los resultados de la prueba de integridad húmeda indican la resistencia física de la estructura cuando se encuentra o interactúa con la sangre o los exudados de la herida21. El cambio en la estructura física, como el ablandamiento o la formación de gel o la rotura de la estructura polimérica en el lugar de aplicación y la retirada del apósito del lugar de la lesión, también implica la facilidad de cumplimiento del paciente. La Figura 3C representa las imágenes capturadas durante el estudio que indican que Ch NFRCS y Cp NFRCS estaban intactas o mantenían la estructura, lo que garantiza la facilidad de extracción y pueden soportar la contrapresión provocada por la sangre.

Se determinó la integridad de la capa superficial, lo que asegura la integridad de la superficie del NFRCS durante el transporte, embalaje, almacenamiento y aplicación. Como los HFFC (Ch y Cp) estaban compuestos de polímeros solubles en agua y un exceso de polímero depositado en la superficie superior del Ct, se observó una pérdida de 21,69 ± 0,30 % (Ch NFRCS) y 20,91 ± 0,15 % (Cp NFRCS) después de 30 min de exposición a ondas sónicas. Se registró una pérdida mínima de HFFC después de 30 minutos debido a la estructura compacta del NFRCS. La Figura 3D representa la integridad del gráfico de la capa de superficie (se trazó el porcentaje de pérdida de HFFC de NFRCS en el eje Y y el tiempo en el eje X). Se observó una diferencia significativa entre Ch y Cp NFRCS con ***p < 0,0001%.

Se determinó la uniformidad de NFRCS de Ch NFRCS y Cp NFRCS. El BCT promedio fue de 65 ± 6,70 y 15 ± 0,00 s de Ch NFRCS y Cp NFRCS. Las cinco muestras diferentes recortadas de diferentes porciones de 15 × 15 cm2 mostraron BCT similares, lo que confirma la distribución uniforme de HFFC.

Se determinó la NBCA de NFRCS; el Ct absorbió la sangre rápidamente en comparación con Ch NFRCS y Cp NFRCS. Cp NFRCS (11,00 ± 1,73%) mostró menos NBCA que Ch NFRCS (11,5 ± 2,17) y Cs (17,25 ± 1,29). La Figura 3E representa la NBCA de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Ct. La coagulación de la sangre en presencia de material hemostático podría ser un factor que influye en la NBCA del material o NFRCS (NBCA es directamente proporcional al BCT de la NFRCS). Se observó una diferencia significativa entre Cs y Cp NFRCS con *p < 0,05%.

La capacidad de absorción de humedad del NFRCS se estimó mediante análisis DVS. La Figura 3F representa la absorción del contenido de humedad por Ch NFRCS y Cp NFRCS con los diferentes niveles de RH a lo largo del perfil de tiempo durante la ejecución de la isoterma. Con respecto a las pautas de la Farmacopea Europea, según el porcentaje de ganancia de humedad de la NFRCS, se puede concluir que Ch NFRCS y Cp NFRCS eran higroscópicos. El porcentaje de absorción de humedad por Ch NFRCS y Cp NFRCS fue de 7,6% y 6,8% respecto al peso inicial. Ambas muestras tienen una capacidad de absorción de humedad similar (< 1 %) debido a la composición de HFFC (tanto Cp NFRCS como Ch NFRCS contienen 0,05 % de PVA K30). El PVA consta de grupos hidroxilo hidrófilos que interactúan con el agua; de manera similar, en el caso de HPMC, consta de sustituciones hidroxipropilo hidrófilas y grupos metoxilo hidrófobos, que exhiben baja higroscopicidad56.

La Tabla complementaria S3 representa los resultados BET de Cp NFRCS y Ch NFRCS. Se encontró que la superficie total de Ch NFRCS y Cp NFRCS era 20,479 m2/g y 11,295 m2/g, respectivamente. El diámetro de poro promedio de Cp NFRCS y Ch NFRCS fue <3 nm.

Se determinó la EAgT de Ch HFFC, Cp HFFC y solución de Cs al 3%. Los eritrocitos mostraron aglutinación granular completa o compacta (+ + + +) sin sobrenadante en presencia de Cp HFFC y control negativo. Los resultados de Cs estuvieron de acuerdo con los resultados reportados anteriormente12. Ch HFFC mostró una estera lisa en el fondo del pocillo con bordes irregulares (++) con poco sobrenadante. La Figura 3G muestra imágenes EAgT de todas las muestras de prueba.

La naturaleza no trombogénica del andamio es uno de los factores críticos de los biomateriales o materiales hemostáticos. El porcentaje de trombogenicidad de Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS fue de 4,63 ± 0,23%, 2,33 ± 0,11% y 2,65 ± 0,39%, respectivamente (Figura complementaria S5). Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS mostraron una diferencia significativa con p <0,0001%. Los Ch NFRCS y Cp NFRCS mostraron un menor porcentaje de trombogenicidad que el andamio Cs, lo que confirma la naturaleza no trombogénica de los NFRCS desarrollados. Otros factores incluyen la hidrofilicidad, la composición química, la topología de la superficie y la morfología que influyen en la potencia hemolítica de los selladores quirúrgicos57,58.

Las imágenes microscópicas de 4 × y 10 × de NFRCS de Ch y Cp mostraron una deposición de HFFC (capa delgada) en la superficie de Ct y una deposición de polímero en la red de Ct (Fig. 4A). El Cp NFRCS mostró más deposición de polímero en la superficie de Ct que el Ch NFRCS.

El análisis estructural de Ch NFRCS y Cp NFRCS mediante diversas técnicas. (A) Representa la deposición de HFFC en la superficie del Ct y la deposición excesiva de polímero en la red de interconexión de fibras (micrografía capturada a 4 × y 10x). (B) Las imágenes microscópicas (4x) representan la disposición de HFFC en la red de Ct mediante el uso de un microscopio fluorescente. (C) Las imágenes FESEM muestran la interconexión de la fibra Ct, la formación de película entre las fibras Ct y el recubrimiento superficial uniforme en la superficie de las fibras Ct. (D) representa la morfología de la superficie (rugosidad de la superficie) de Ch NFRCS y Cp NFRCS a 2 µm y 5 µm de altura usando AFM. Las imágenes 3D se reconstruyeron utilizando MountainsLab® Premium 8.2.9526 (https://www.digitalsurf.com/support/software-updates/), y a 2 µm de altura, Ch mostró una mejor suavidad de la superficie que Cp NFRCS. (E) Las imágenes FESEM muestran la formación de coágulos de sangre en la superficie de NFRCS, la integridad del coágulo de glóbulos rojos, la formación de coágulos en la superficie de Ct a nivel submicrónico y la formación de poliedrocitos confirman la integridad del coágulo en presencia de Cp NFRCS .

Las imágenes capturadas a 4 × revelaron que Cp NFRCS mostró una mejor interconexión de Ct y un exceso de deposición de HFFC en la red de Ct (la intensa fluorescencia producida por los HFFC entre los Ct). La Figura 4B representa la micrografía fluorescente de Ch NFRCS que no muestra un exceso de deposición de HFFC en la superficie de Ct y entre la red de Ct. La micrografía fluorescente Cp NFRCS mostró un exceso de deposición de polímero entre la red Ct y la superficie (Fig. 4B).

Utilizando AFM, se estudió la morfología de la superficie del NFRCS. La topología de NFRCS se escaneó a 2 y 5 µm2. Las Figuras 4C y D representan la morfología de la superficie y el marco estructural de Ch NFRCS y Cp NFRCS, respectivamente. La región de color blanco representa las protuberancias en la superficie del NFRCS y los otros colores como rojo, verde y azul representan las depresiones del NFRCS. Las imágenes 3D generadas con MountainsLab® Premium 8.2.9526 proporcionaron una profundidad decente para comprender la superficie del NFRCS. En general, la topología de la superficie obtenida del AFM sugiere que Ch NFRCS (el valor RMS de 2 µm es 0,011 y 5 µm es 0,059) exhibió más suavidad superficial en comparación con Cp NFRCS (el valor RMS de 2 µm es 0,024 y 5 µm es 0,044).

La morfología de Ch y Cp NFRCS y las muestras de Ch NFRCS y Cp NFRCS tratadas con sangre se estudiaron utilizando FESEM. Las imágenes obtenidas de FESEM con diferentes aumentos confirman el recubrimiento uniforme de HFFC en la superficie del Ct, y HFFC pudo interconectar los Ct dispuestos aleatoriamente. La Figura 4C muestra las proyecciones de películas de tamaño nano (n) a micras (μ) en la superficie de Ch NFRCS y Cp NFRCS. La Figura 4B muestra el exceso de deposición de polímero entre la red de Ct reflejada en la formación de NFRCS. La disposición aleatoria de Ct facilitó la consecución de NFRCS uniforme con un tamaño de nanoporo (<3 nm).

Además, Ch NFRCS y Cp NFRCS tratados con sangre mostraron una formación de coágulo intacta en la superficie de NFRCS (Fig. 4Ea). La formación de coágulos o una mayor adhesión de glóbulos rojos en la superficie de Ct fue mayor en el caso de Cp NFRCS en comparación con la superficie de Ch NFRCS (Fig. 4Ea yb). Las imágenes FESEM modificadas de Ch NFRCS y Cp NFRCS mostraron la capa de superficie hemostática de película de nano espesor uniforme y se observó formación de coágulos en el nivel submicrónico como se muestra en la Fig. 4E (c). Los glóbulos rojos presentes en Ch NFRCS permanecieron intactos, lo que confirma la compatibilidad de HFFC con RBC. Por otro lado, los glóbulos rojos presentes en la superficie de Cp NFRCS mostraron un cambio en la morfología (forma poliédrica) que se denominaron poliedrocitos (Fig. 4Eb). La formación de poliedrocitos en la superficie de Cp NFRCS confirma la integridad del coágulo. Además, los poliedrocitos mejoran la resistencia mecánica del coágulo. El coágulo intacto tiene el potencial de alterar la permeabilidad de las enzimas trombolíticas para disolver el coágulo59.

Los iones elementales Na+, Mg2+, K+, Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn+ y Se4+ se mapearon en la superficie de NFRCS de Ch NFRCS, Cp NFRCS y Ch NFRCS, Cp NFRCS tratados con sangre. Los resultados del mapeo elemental mostraron un aumento en la acumulación de iones elementales en el coágulo de sangre, de lo cual podemos entender que la formación del coágulo fue excelente y uniforme. El exceso de concentración de iones Na+ se debió a la sangre premezclada con citrato de sodio utilizada para el estudio. Las imágenes mapeadas por FESEM mostraron en la Fig. 5A (a) y (b) una distribución uniforme de iones elementales en Ch NFRCS y Cp NFRCS tratados con sangre, respectivamente. Junto con el Ca2+, informes publicados previamente concluyeron que el Mg2+ y el Na+ desempeñan un papel esencial en la coagulación sanguínea60,61. Los iones Mg2+ aceleran la activación del factor X por el factor IXa en presencia de factor VIIIa, fosfolípidos e iones Ca2+ y aumentan la actividad catalítica61. Los iones Na+ ayudan a la trombina a activar significativamente los receptores activados por fibrinógeno y proteasa (PAR1) y desencadenar la acumulación inicial de factores Va, VIIa y XIa, que generan trombina. Sezer et al. 62 informaron que la celulosa regenerada oxidada reticulada con iones K+ mostró una mejor actividad hemostática en comparación con el Ct, lo que refleja que la reticulación de iones K+ mejoró la capacidad de coagulación de la sangre62. Los iones Zn+ desempeñan un papel vital en la agregación plaquetaria, la hemostasia, la anticoagulación y la fibrinólisis.

FESEM, mapeo EDS y micro-CT de muestras NFRCS. (A)a). Mapeo FESEM-EDS de Ch NFRCS y Ch NFRCS tratados con sangre; b). Mapeo FESEM-EDS de Cp NFRCS y Cp NFRCS tratados con sangre. (B) Representación gráfica de iones elementales mapeados en NFRCS de Ch y Cp tratados y no tratados con sangre, (C) Espesor de la capa superficial en la superficie de Ct mediante el uso de FESEM (el HFFC pudo formar una película de nanoespesor que oscila entre 150 y 500 Nuevo Méjico). (D)a). Representa la imagen micro-CT modificada en 3D del software ScanIP Academic (https://www.synopsys.com/simpleware/software.html) de una vista cercana de NFRCS; b). La imagen representa la imagen micro-CT modificada de Cp NFRCS después del tratamiento sanguíneo.

En consecuencia, el zinc actúa como un interruptor para regular la coagulación e inhibe el proceso activando vías inhibidoras compensatorias63. Los iones metálicos en el NFRCS (muestra no tratada) se debían al Ct utilizado para desarrollar NFRCS. Un estudio publicado anteriormente afirma que Ca2+, Na+, Mg2+, Cu2+, Zn+, K+ eran dominantes en Ct64. En el informe anterior publicado, los autores especularon que el Cu2+ es esencial para mantener la estructura heterodimérica en concentraciones fisiológicas del factor VIII65. Los iones de cobre aumentan la actividad del factor VIIIa66. Los iones de cobre unen los dominios A1 y A3 del factor VIII para mejorar la afinidad en aproximadamente 100 veces, manteniendo la estructura hidrodinámica de la concentración del factor VIII65. El Se4+ es un microinmunonutriente vital que mantiene la actividad metabólica del individuo mediante enlaces químicos. La glutatión peroxidasa es una de las selenoproteínas importantes que favorece la regulación de la producción excesiva de radicales libres en el lugar de la lesión o la inflamación67. El ion elemental adicional que se encuentra en el mapeo es Fe2+; La ceruloplasmina convierte el Fe2+ ferroso en Fe3+ (ion férrico), lo que ayuda a unirse a la transferrina68. Los iones Fe3+ dan como resultado la formación de coágulos de fibrina insoluble69. A excepción de los iones Ca2+, Zn2+ y Se4+, se observó un aumento en la concentración del ion elemental en las muestras tratadas con sangre (Figura 5Aa yb). La Figura 5B representa el número de iones elementales presentes en NFRCS de Ch y Cp no tratados y tratados con sangre. Un aumento en la concentración de iones podría deberse a la acumulación de micro iones elementales en la sangre involucrados en la cascada de coagulación sanguínea. El aumento en la concentración de iones elementales confirma la uniformidad y la formación natural de coágulos en presencia de NFRCS.

Con base en los estudios anteriores (BCT, formación de coágulos en la superficie de la fibra de Ct recubierta con superficie de Cp (Fig. 4E), concluimos que Cp NFRCS fue la mejor composición de HFFC. Además, el espesor de la capa superficial de HFFC se estimó mediante FESEM. El espesor de la capa de película de Cp HFFC en la superficie de Ct varía de 150 a 500 nm. La Figura 5C representa las imágenes FESEM modificadas de la superficie de la película de nano espesor recubierta en la superficie de Cp NFRCS.

Los resultados obtenidos confirmaron que no había espacios vacíos ni una distribución desigual de Ct en la imagen de micro-CT procesada de Cp NFRCS (Fig. 5Da). No pudimos analizar el tamaño de los poros utilizando micro-CT porque el tamaño de los poros de Cp NFRCS era <3 nm. La Figura 5Db representa la imagen de Cp NFRCS tratado con sangre. El BAR in vitro mostró que todo el NFRCS podía absorber sangre y que todo el NFRCS era de color rojo. La imagen de micro-CT modificada de Cp NFRCS (Fig. 5Db) mostró un color blanco (sangre absorbida), en el que Cp HFFC inició instantáneamente la coagulación de la sangre debido a que la sangre no se extendió a toda el área de NFRCS.

Las infecciones microbianas son una de las preocupaciones importantes que pueden causar complicaciones graves. Tanto Cp HFFC como Cp NFRCS fueron activos contra todos los microorganismos de prueba. La Figura 6A representa la actividad antimicrobiana de Cp HFFC y Cp NFRCS contra S. aureus, E. coli y C. albicans. Las imágenes digitales capturadas durante el estudio de Cp HFFC y Cp NFRCS mostraron una clara zona de inhibición (Figura complementaria S6). El Cp NFRCS tiene más zona de inhibición contra S. aureus y C. albicans que E. coli, mientras que el Cp HFFC exhibió más zona de inhibición que el Cp NFRCS. El Cp HFFC podría difundirse más en el medio de agar nutritivo que el Cp NFRCS. La zona de inhibición del Cp NFRCS fue un 15,53% menor que el Cp HFFC para E. coli y un 23,16% menor para S. aureus y C. albicans. Como el NFRCS estaba intacto y el HFFC atrapado en la red Ct, no podía difundirse desde la fase dispersa. Además, la zona de cambio de inhibición se debió a diferencias estructurales en la pared celular de los microorganismos. La pared celular de la bacteria gramnegativa (E. coli) consta de una bicapa con una capa externa de lipopolisacárido, lo que dificulta que las HFFC se inactiven o muestren su actividad70. Cp HFFC mostró una diferencia significativa con ***p < 0,0001% en comparación con Cp NFRCS.

Diversos estudios de caracterización in vitro e in vivo de NFRCS. (A) El gráfico representa la actividad antimicrobiana Cp HFFC y Cp NFRCS contra tres microorganismos diferentes. (B) Representa el gráfico generado por el sistema N-TEG de Cp HFFC, que muestra una reducción en el valor R, lo que indica el inicio rápido de la coagulación sanguínea en presencia de 10 l de Cp HFFC. (C, D, E) Representan las imágenes capturadas durante el tratamiento y la hemostasia después de colocar material de apósito de varias muestras durante la BCT in vivo de amputación de cola, arteria femoral superficial y modelo de lesión hepática, respectivamente. (F) El gráfico representa el BCT de NFRCS en todos los modelos animales. (G) El gráfico representa el perfil comparativo de cicatrización de heridas de C, Ct, Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS en el modelo de herida por escisión; Cp NFRCS mostró el mejor porcentaje de cierre de heridas (12,22 ± 0,25%) en comparación con otras muestras. (H) Representa las micrografías de C (control) y Cp NFRCS (mostró un mejor progreso de curación) teñidas con H&E y tinción tricrómica de Masson. Se observó formación de epidermis y vasos sanguíneos en el grupo tratado con Cp NFRCS, y se observó formación de colágeno maduro en Cp NFRCS mediante tinción con tricrómico de Masson. (I) Las imágenes representan el lote ampliado de Cp NFRCS (15 × 15 cm2), tampón y tampón en forma de cono desarrollado para diferentes aplicaciones biomédicas. Los datos en A, F y G se representan como media ± DE, n = 3 con *p < 0,05.

Se determinó la propiedad de viscoelasticidad de la sangre humana con Cp HFFC (10 µL y 50 µL). Se compararon la curva N-TEG y los parámetros de coagulación, incluido el tiempo de reacción (R), el ángulo α y la amplitud máxima de Cp HFFC (10 µL y 50 µL) con sangre completa. La curva N-TEG no mostró diferencias en el valor R de Cp HFFC en dos concentraciones diferentes ((< 0,1 min), 10 µL (7,4 min), 50 µL (7,5 min)), y la muestra de control mostró más valor R (9,1 min) que Cp HFFC. El valor R del control fue menor que el rango de referencia (12 a 26 min); esto podría deberse a la activación del factor de coagulación después de la extracción de sangre del sujeto. El Cp HFFC podría intensificar significativamente la velocidad de coagulación, a pesar de la mínima cantidad de material polimérico. En presencia de Cp HFFC, la sangre entera mostró hipercoagulación (basada en el valor R de 10 µL (7,4 min), 50 µL (7,5 min)), que es menor que el rango de referencia (12 a 26 min) independientemente de la concentración de Cp HFFC. . El aumento en el volumen de Cp HFFC exhibió un aumento en α-el ángulo. La firmeza del coágulo (G) fue mayor para 10 µL de Cp HFFC (7,2 d/sc) en comparación con 50 µL de Cp HFFC (6,5 d/sc) y el control (6,4 d/sc). El valor de MA de 10 µl de Cp HFFC (58,9 mm) fue mayor que el de 50 µl y el control (56,1 mm), lo que indica una mayor agregación plaquetaria durante la coagulación sanguínea. El aumento en el volumen de Cp HFFC (50 µL) resultó en una disminución en el valor de MA debido al consumo de plaquetas en la formación del coágulo. La Figura 6B representa el gráfico N-TEG generado por el sistema de 10 µL de Cp HFFC. La Figura complementaria S7 representa el gráfico de control generado por el sistema y 50 µL de HFFC. Tabla complementaria S4. muestra todos los valores de N-TEG de Cp HFFC (10 µL), Cp HFFC (50 µL), sangre completa (control).

Los Ch y Cp NFRCS exhibieron BCT in vitro preferible. La actividad farmacodinámica del NFRCS desarrollado se estudió en varios modelos animales para comprender y estimar la eficacia de la composición en lesiones intraoperatorias y externas. El BCT y la pérdida de sangre en todos los modelos animales (modelo de perforador de hígado de rata, modelo de amputación de cola de rata y modelo de arteria femoral superficial) se estimaron y presentaron en la Figura complementaria S8.

El BCT de las muestras de prueba se estimó en el modelo de amputación de cola de rata. El BCT de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs fue de 367 ± 18,08 s, 194,66 ± 14,57 s, 124,33 ± 8,71 s y 175 ± 3,21 s, respectivamente. El BCT de Cp NFRCS fue menor que el de Ch NFRCS, Cs y Ct. La pérdida de sangre in vivo de Cp NFRCS fue menor que la de Ch NFRCS, Cs y Ct (95,3 ± 23 mg, 258 ± 72,10 mg, 108 ± 13,52 mg y 2473 ± 62,20 mg, respectivamente). Cs y Cp NFRCS mostraron una diferencia significativa en BCT con *p <0,05%. La pérdida de sangre fue mayor en el caso del algodón en comparación con Cp NFRCS, Ch NFRCS y Cs. La Figura 6C muestra las imágenes in vivo capturadas durante el estudio de amputación de cola de rata.

El BCT de las muestras de prueba se estimó en el modelo de arteria femoral de rata. Como se representa en la Fig. 6D, la arteria femoral quedó expuesta y se pinchó con una aguja de 24 G. Ch NFRCS, Cp NFRCS, Cs y Ct exhibieron BCT de 104,33 ± 12,01 s, 40 ± 5,56 s, 50 ± 7,54 s y 124,33 ± 24,00 s, respectivamente. BCT fue significativamente menor en Cp NFRCS que en otras muestras de prueba (Cp NFRCS y Ch NFRCS; Cs y Cp NFRCS ***p < 0,0001%). Cp NFRCS mostró una diferencia significativa en la pérdida de sangre (45,30 ± 3,05 mg), en comparación con Ch NFRCS, Cs y Ct (205 ± 48,60 mg, 59,70 ± 14,84 mg y 394 ± 9,00 mg respectivamente) con *p < 0,05%. Cp NFRCS tuvo el BCT y la pérdida de sangre más bajos de todas las muestras de prueba, lo que indica una alta eficiencia de coagulación de Cp NFRCS.

El BCT de las muestras de prueba se determinó en el modelo de lesión hepática de rata. Las Figuras 6E y 6F representan las imágenes del modelo de lesión hepática capturadas durante el estudio y BCT de las muestras de prueba. El BCT de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs fue de 124 ± 18,08 s, 138,33 ± 14,57 s, 59 ± 8,71 s y 126,33 ± 3,21 s, respectivamente. La pérdida de sangre in vivo de las muestras de prueba de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS y Cs fue de 130,70 ± 10,08 mg, 218 ± 52,84 mg, 131,00 ± 41,04 mg y 191,30 ± 14,57 mg, respectivamente. Cp NFRCS tiene menos BCT con una pérdida de sangre mínima entre todas las composiciones. Cs mostró mejor BCT que Ch NFRCS con menos pérdida de sangre. Durante el estudio con animales, no se aplicó presión para restringir el flujo sanguíneo procedente de la lesión hepática, lo que demuestra que el Cp NFRCS podría emplearse eficazmente en lesiones no compresibles (lesiones internas o hemorragias intraoperatorias). Cs, Ch NFRCS y Cp NFRCS mostraron una diferencia significativa con ***p <0,0001%. Cp NFRCS mostró una eficiencia hemostática superior en los tres modelos animales con menos pérdida de sangre hemorrágica entre todas las muestras de prueba. La coagulación iniciada por la composición de Cp HFFC como HFFC consiste en PVA y PVP K 30, que eran altamente hidrófilos en comparación con HPMC y quitosano. Por el contrario, el Cp HFFC podría absorber sangre y acumular muchos eritrocitos y plaquetas en la superficie de la lesión para formar una barrera física (Fig. 4Eb)45. La Figura 6F representa el gráfico BCT comparativo de todas las muestras del modelo animal.

NFRCS se utilizó para tratar heridas de espesor total (12 mm) que se muestran en la (Figura complementaria S9). Por lo general, la CT interfiere con la cicatrización de la herida al adherirse a la superficie de una herida abierta y puede causar dolor al retirar o cambiar el apósito71. Se estudió el efecto de Ct y se comparó con el efecto de NFRCS. La observación macroscópica de heridas de espesor total en ratas mostró una reducción significativa en el porcentaje del área de la herida de los grupos tratados con Cp NFRCS, Ch NFRCS y Cs (12,22 ± 0,25 %, 19,44 ± 0,57 % y 31,94 ± 0,28 %) en comparación con C y grupos Ct. En el segundo día del experimento, los grupos tratados con andamios Ch NFRCS, Cs y Cp NFRCS mostraron heridas secas, lo que confirma que el andamio Cp NFRCS, Ch NFRCS, Cs podría absorber la humedad, mantener el microambiente mediante el intercambio de gases y también Inflamación regulada50. El día 12 del estudio, el grupo tratado con Cp NFRCS exhibió el área máxima de cierre de la herida (12,22 ± 0,25 %) que otros grupos tratados con muestras de prueba.

En la superficie de las heridas tratadas con Ch NFRCS y Cp NFRCS, no se adhirieron fibras de algodón (sin adhesión del tejido), lo que confirmó el recubrimiento uniforme de la superficie del Ct por parte del HFFC. De acuerdo con los resultados de la observación macroscópica, la Fig. 6G muestra el gráfico del ensayo de cicatrización de heridas. El HFFC compuesto de 0,5% de PVA y quitosano posee una tasa de curación de heridas más rápida que los grupos C, Ct, Cs y Ch NFRCS. Los resultados revelan que la alta tasa de cierre de las heridas tratadas con Cp NFRCS podría contribuir a una mejor inflamación y control antimicrobiano en la etapa inicial del proceso de cicatrización de la herida50. Además, se extirpó la muestra de piel tratada con Cp NFRCS y se estudió la histopatología de las muestras de piel para comprender el efecto de la composición de HFFC en la formación de epitelio, granulación y formación de colágeno maduro. Se observó una diferencia significativa entre las muestras de prueba (Cs y Ch NFRCS *p < 0,01%; Cs y Cp NFRCS p < 0,0001%).

Las muestras de piel del grupo tratado con Cp NFRCS y control (C) se extirparon y se almacenaron en formalina al 10 % durante 48 h y se estudiaron mediante tinción con hematoxilina y eosina (H y E) y tricrómico de Masson. En el grupo tratado con Cp NFRCS, la epidermis recién formada era gruesa y sana sin ninguna interferencia entre el tejido huésped y el tejido recién desarrollado, lo que indica que Cp HFFC favoreció la regeneración del tejido y el desarrollo de la matriz extracelular. La organización del epitelio en el grupo tratado con Cp NFRCS se parece mucho a la piel natural debido a la inmovilización estable y la liberación sostenida de PVA y quitosano en el sitio de aplicación. El grupo C exhibió tejido epitelial incompleto o desorganizado (Fig. 6H) dentro de la interferencia entre el tejido regenerado y el del huésped, lo que indica una mala cicatrización de la herida. La imagen de 40 aumentos capturada del grupo tratado con Cp NFRCS mostró granulación en tejido con vasos sanguíneos recién formados (Fig. 6H) y proliferación de vasos sanguíneos (color azul) (Fig. 6H). La imagen de 40 × del grupo Cp NFRCS mostró la organización de los macrófagos en el tejido de granulación y la formación de epitelio sobre el tejido de granulación (Fig. 6H). El grupo C mostró un área de costra inadecuada por encima del tejido de granulación (Fig. 6H). La imagen de 40 aumentos del grupo C mostró células de fibroblastos en proliferación (rojo), vasos sanguíneos y células inflamatorias agudas. Después de la tinción con tricrómico de Masson, el grupo tratado con Cp NFRCS exhibió una formación mejorada de colágeno maduro con deposición y alineación de fibras.

Se determinó la estabilidad de Cp NFRCS a temperatura ambiente. No hubo cambios en la compacidad o resistencia mecánica del Cp NFRCS. La resistencia al plegado fue > 1000 veces. El BCT de la muestra de estabilidad de Cp NFRCS fue como el de la muestra fresca (15 ± 0,00 s). No hubo crecimiento microbiano ni cambio de color, ni liberación de fibras del Cp NFRCS, lo que confirma la estabilidad del Cp NFRCS. La Figura complementaria S10 y la Tabla S6 representan la imagen de muestra de referencia de Cp NFRCS y los datos de estabilidad.

Se determinó el BCT de Cp NFRCS a escala piloto desarrollado (NFRCS de tamaño 15 × 15 cm2) de cinco porciones diferentes (Fig. 6I). El BCT promedio de cinco porciones diferentes del lote ampliado fue de 15 s ± 0,00 (Tabla complementaria S5).

La composición de Cp HFFC pudo moldearse según la estructura del molde de fundición y pudo formar la estructura según el diseño. El tampón o estructura en forma de cono o tampón nasal obtenido confirma la capacidad de HFFC, y algunas composiciones también se pueden usar para desarrollar diferentes estructuras para diversas aplicaciones biomédicas. La Figura 6I muestra las formas modificadas de NFRCS (tampón y tampón en forma de cono) para diferentes aplicaciones biomédicas. Cp NFRCS se puede modificar en muñequeras recubriendo la superficie de la capa adhesiva, lo que ayuda a salvar vidas en la aplicación de lesiones profundas en la muñeca.

El estudio tuvo como objetivo desarrollar NFRCS utilizando Ct como material de refuerzo y diseñado para lograr andamios bioactivos nanoporosos topológicos y Ct recubierto con película de nanoespesor con una utilización mínima de polímero para diferentes aplicaciones biomédicas (Fig. 6I). La superficie diseñada con nanoestructura puede ayudar a lograr una hemostasia rápida en el sitio de aplicación19. NFRCS logró una coagulación mejorada y acelerada al desintegrar pequeñas estructuras de película presentes en la superficie (Fig. 4C) de una fase dispersa en un charco de sangre en el sitio de aplicación.

Las composiciones de Cp HFFC dieron como resultado una coagulación sanguínea rápida y una formación de coágulos intactos sin pérdida de sangre (Fig. 3Bb). NFRCS mostró una adhesión tisular mínima in vitro e in vivo, lo que previene el sangrado secundario mientras se desviste el tejido en curación o lesionado, lo que cumple con la facilidad de cumplimiento del paciente. La mínima adhesión del tejido evita problemas graves debido a la fuerte adhesión del coágulo que afecta la aplicación de materiales de apósito hidrófilos. La NFRCS actúa como plantilla de administración de fármacos y sustrato de base hemostática. Se pueden cargar otras clases de moléculas activas en una película de nanoespesor, lo que mejora los sistemas de administración transdérmica de fármacos y amplía sus aplicaciones. De hecho, se puede utilizar para lesiones de bala aumentando el grosor del NFRCS para personalizarlo para diferentes sitios en las extremidades inferiores, el cuello y otras ubicaciones sensibles del cuerpo del sujeto. La capa de superficie del Ct puede resistir incluso cuando se expone a tensiones mecánicas o externas. El Cp NFRCS exhibió una actividad antimicrobiana prometedora, que previene significativamente los ataques microbianos.

Debido a esto, Cp NFRCS mantiene una zona estéril en el lugar de aplicación y reduce la carga de microbiota patógena y su propagación, una de las preocupaciones importantes de los accidentes intraoperatorios, de combate o de carretera. Debido a su biocompatibilidad y ensayos in vitro probados cualitativamente, el NFRCS fue compatible y seguro en aplicaciones de lesiones internas y externas. El enfoque de nanoestructuración (tamaño de poro <3 nm) ayuda a proteger el tejido de la exposición directa al ambiente externo o partículas de polvo con un intercambio de gases y transpirabilidad adecuados. NFRCS se puede modificar en forma de rollo, que es simple y fácil de transportar. Cp NFRCS exhibe una alta eficacia y una mejor capacidad de curación de heridas en comparación con Cs (quitosano puro) al mantener el contenido de humedad y el intercambio de gases óptimos durante la curación de heridas, lo que hace que NFRCS se atribuya a un sellador quirúrgico multifuncional. Los estudios revelan y demuestran que la superficie nanoestructurada ayuda a una coagulación rápida con una mínima pérdida de sangre y muestra una menor adhesión al tejido. Teniendo en cuenta todos los atributos cualitativos dilucidados anteriormente, el material multifuncional formador de película nanoporoso y de nanoespesor producido en esta investigación ofrece el potencial de avanzar en el estado del arte de los apósitos hemostáticos o para heridas. NFRCS se puede utilizar para diversas aplicaciones biomédicas, de bioingeniería y de terapia celular y molecular. Las fibras de celulosa son una alternativa de refuerzo de fibras para implantes y uso interno. Con este logro, la estrategia o enfoque de estudio y diseño de materiales desarrollado siguiendo los métodos adoptados ayuda a analizar y aumentar el alcance del desarrollo de productos biomédicos más eficientes, aumentando el número de descubrimientos en el campo de las aplicaciones biomédicas y clínicas para salvar a la humanidad.

La investigación actual diseñó NFRCS con estructura nanoporosa y película de nanoespesor recubierta de superficie para Ct con su caracterización completa in vitro e in vivo para determinar las actividades hemostáticas y de curación de heridas. Los estudios concluyen que el NFRCS diseñado con material de refuerzo de fibra Ct exhibió una buena topología con resistencia física y mecánica con excelentes propiedades hemostáticas y de curación de heridas. Todo el concepto es una obra maestra que puede diseñar y desarrollar prototipos NFRCS con diferentes características topológicas. El diseño propuesto se puede implementar en los campos de las Ciencias Biomédicas y la Bioingeniería para diversas aplicaciones.

Todos los conjuntos de datos que respaldan los hallazgos de esta investigación están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Todos los autores desean agradecer a Manipal College of Pharmaceutical Sciences, Kasturba Medical College y Manipal Academy of Higher Education, Manipal (India), por proporcionar todas las instalaciones necesarias para llevar a cabo la investigación sin problemas.

Todo el equipo de investigación agradece al Consejo Indio de Investigación Médica, Delhi, por otorgar la subvención ICMR-SRF como beca a Naga Thirumalesh Chevala (ICMR-SRF, número de subvención: 45/07/2020-Hae/BMS).

Departamento de Farmacéutica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Manipal, Academia de Educación Superior de Manipal, Manipal, Karnataka, 576104, India

Naga Thirumalesh Chevala y Lalit Kumar

Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Manipal, Academia de Educación Superior de Manipal, Manipal, Karnataka, 576104, India

Vimal Veetilvalappil y Aranjani Jesil Mathew

Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Manipal, Academia de Educación Superior de Manipal, Manipal, Karnataka, 576104, India

C. Mallikarjuna Rao

Departamento de Inmunohematología y Transfusión de Sangre, Kasturba Medical College, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, 576104, India

Bemma Paonam, Ganesh Mohan y Shamee Shastry

Departamento de Ingeniería Mecánica, Instituto Indio de Tecnología, Madrás, India

Krishnan Balasubramanian

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NTC diseñó, llevó a cabo la mayoría de los experimentos (estudios in vitro e in vivo), interpretación y evaluación de datos y redactó el artículo. LK y CMR evaluaron y supervisaron todo el trabajo. VV y AJM realizaron un ensayo antimicrobiano. BP, GM y SS ayudaron a realizar N-TEG. KB ayudó en la realización de un experimento de microtomografía computarizada y su evaluación. Todos los autores discutieron los resultados.

Correspondencia a Lalit Kumar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Chevala, NT, Kumar, L., Veetilvalappil, V. et al. Composición bioactiva formadora de película nanoporosa y de nanoespesor para aplicaciones biomédicas. Representante científico 12, 8198 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12280-8

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Recibido: 18 de diciembre de 2021

Aceptado: 25 de abril de 2022

Publicado: 17 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12280-8

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